酶免疫分析——技術(shù)進(jìn)步與自動化

酶免疫分析（Enzyme Immunoassay,EIA）是標(biāo)記免疫分析中的一項(xiàng)重要技術(shù),是以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專一性結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)。作為經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)之一,酶免疫技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用并不斷得到更新，不斷和其他先進(jìn)技術(shù)如熒光、發(fā)光技術(shù)以及儀器自動化相融合，日臻完善,許多自動化儀器實(shí)際上是EIA技術(shù)和其他現(xiàn)代化技術(shù)的復(fù)合體，其分析敏感度已達(dá)到甚至大大超過放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)的水平，因試劑穩(wěn)定無放射性污染且分析形式日趨多樣化，簡易靈活，臨床應(yīng)用廣泛而倍受重視。

一、酶免疫分析的技術(shù)進(jìn)步

近年來，EIA技術(shù)取得了顯著的發(fā)展，主要表現(xiàn)在以下方面：

1、 繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應(yīng)用，明顯地提高了檢測的特異性，基本消除了抗原、抗體間的非特異性交叉反應(yīng)，保證了分析的準(zhǔn)確性。抗體制備技術(shù)的進(jìn)步，使試劑的生產(chǎn)制備得以規(guī)模化，檢測范圍日益擴(kuò)展，小分子抗原、半抗原的檢測成為事實(shí)。

2、 分析方式的改進(jìn)與多樣化提高了試驗(yàn)的敏感性。

（1） 除早期的競爭法，間接法外，又發(fā)展了雙抗原夾心法測抗體，偶聯(lián)酶標(biāo)記法測抗原，橋聯(lián)酶免疫分析，酶放大免疫分析技術(shù)等，后者應(yīng)用了生物素-親和素系統(tǒng)，底物循環(huán)放大系統(tǒng)，酶-抗酶放大系統(tǒng)及酶偶聯(lián)放大系統(tǒng)等。

（2）由于酶標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步，標(biāo)記酶的應(yīng)用已從過氧化物酶，擴(kuò)展到堿性磷酸酶，β半乳糖苷酶，尿素酶，葡萄糖6磷酸脫氫酶，葡萄糖氧化酶，蘋果酸脫氫酶，至今有二十多種酶被應(yīng)用于EIA ，但應(yīng)用最多的仍然是辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（Alkalinephasphotase，ALP）。

（3） 酶免疫分析與其它標(biāo)記免疫分析相結(jié)合如與熒光免疫分析（Fluorescence Immunoassay ,FIA）結(jié)合形成熒光酶免疫分析（Fluorescence Enzyme Immunoassay ，F(xiàn)EIA），酶促放大時(shí)間分辨熒光免疫分析（Enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ，EATRFIA），EIA與化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）結(jié)合形成酶—化學(xué)發(fā)光免疫分析，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（ECLEIA）。EIA與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合形成的PCR-EIA分析等。

（4）改進(jìn)固相載體的技術(shù)

傳統(tǒng)ELISA應(yīng)用的固相載體是聚苯乙稀微孔板，聚苯乙烯珠或條，后發(fā)展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結(jié)合容量，增加結(jié)合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面，如用化學(xué)偶聯(lián)法導(dǎo)入功能性醛基、酰基、烷胺基等以更好地與蛋白質(zhì)，多肽的羧基結(jié)合，用位點(diǎn)導(dǎo)向性共價(jià)偶聯(lián)法引入親和素，蛋白A，多聚賴氨酸等，以牢固地捕獲蛋白或多肽，超平整聚苯乙烯表面的制備，克服了表面粗糙帶來的不均一性，達(dá)到平均粗糙度只有2A+的超平整平面，實(shí)現(xiàn)了對蛋白的結(jié)合容量大，脫附率低，孔間均一性好，使試驗(yàn)精密度達(dá)5%。

應(yīng)用于雙抗體夾心法時(shí)，聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，可以增加其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能。近年美國Corning公司研制成功表面經(jīng)琥珀酰亞胺酯活化酶標(biāo)板，其質(zhì)量達(dá)到氨基活化相似水平。

（5）分析方法的創(chuàng)新 如同步ELISA法測定多種抗體是將抗原包被在與微孔相匹配的釘板的釘子上，蓋上釘板的同時(shí)與微孔內(nèi)的所需標(biāo)本、試劑反應(yīng)，是又一種改良ELISA。利用抗體和抗抗體能形成多層復(fù)合物的特性，將常規(guī)二步溫育法改為一步溫育測定法，使檢測時(shí)間大為縮短，現(xiàn)在已廣為應(yīng)用。