1、標本的采集與保存：
ELISA試劑盒當標本采集保存不當產生溶血時，紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質，其通過吸附或“PP效應"（蛋白質間相互吸附的現象）結合后，可催化A、B液顯色而造成假陽性
標本采集保存不當致細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，會產生假陽性反應；標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG聚合，易使間接法的試驗本底加深。因此，標本宜在新鮮時檢測。
反復凍融血清會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。
2、加樣：
ELISA試劑盒如果樣品稀釋液少加或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只有IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標二抗發生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規定的稀釋倍數，極易造成高值陰性。反之，造成假陰性。
如果加入的酶結合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。
如果血液未開始凝固或凝固不*時就強行離心分離血清，此時的血清中仍留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果。
3. 溫育：
由于ELISA試劑盒試驗在一定溫度下的反應時間并不是反應的終點，溫育時間過短、溫度過低，易致顯色不全；溫育時間過長、溫度過高，易致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗*，產生陰性高值或假陽性反應。因此，要嚴格按規定的溫度和溫育時間進行。
由于水浴較難將溫度控制在穩定的范圍，因此我們每次試驗時應認真觀察水浴箱的溫度，盡量少開啟水浴箱門，嚴格控制水浴的溫度為37±0.5。同時，微孔板不可重疊放置，以保證傳熱均勻，各板的溫度都能迅速達到平衡。
由于試劑盒通常設定的反應溫度為37度，在這個溫度下溫育一定時間，蒸發的水分會很多，對于整個反應體系來講，各種反應物的濃度會不斷地增加，這樣必會導致反應zui后的值升高。因此溫育時應貼上封板膠。
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